MicroRNA 分离纯化试剂盒(超滤法)

MicroRNA Extraction and Purification Kit（ultrafiltration）

MicroRNA 分离纯化试剂盒(超滤法)

 【产品简介】

   本试剂盒的裂解抽提试剂采用独特的配方和添加剂，能高效的裂解细胞和组织，有效的去除大片段RNA，富集纯化30bp以下的小RNA。另外本试剂还可以有效地抑制各种外源性和内源性的核酸酶，同时结合特制的纯化柱，能最大限度的保持核酸的完整性、高得率以及纯度。

 【试剂盒组成】

注意：1. 第一次使用前，请按照标签提示往漂洗液WB中加入无水乙醇。

       2. 此试剂盒只提取小于30bp的小RNA，其它大片段基因被除去，因此不适合做microRNA的相对定量实验。

【试剂运输及储存条件】

试剂运输可在常温环境下进行。储存时，可保存在室温。裂解液LB存放于4℃。本试剂盒有效期为12个月，请在有效期内使用。

【操作步骤】

1.       A:从组织中提取总RNA，在冷冻的研钵中切下一小块深层冷冻的组织样品，并用电子天平称量。然后立即将该组织转移至加有1ml裂解液LB的无RNA酶的离心管中，用电动匀浆机在冰浴中匀浆组织约15s直到看不见明显的组织块，之后操作见第2步。

注意：组织样品应储存于液氮或低温冰箱(-80℃)。该实验流程只适用于在小于50mg的组织样品中抽提总RNA，如果样品比较多，则需要适量多加裂解液LB来消化组织。

B:从细胞样品中提取RNA，先把培养皿或培养瓶置于冰上，弃尽培液，用预冷的1XPBS洗涤细胞两次。然后加入1ml裂解液LB，用细胞刮刮下所有细胞，将裂解物转移至无RNA酶的1.5ml离心管中，充分振荡30s，之后操作见第2步。

注意： 1. 试剂盒中不提供 1xPBS，可自行配制。2. 重悬细胞还可以先将细胞2000xg，离心3min，用1XPBS洗涤后再加入1 ml裂解液LB。3. 该实验流程只适用于从少于1 x 10⁷细胞中提取RNA，否则就需要更多的裂解液LB。

2.       把裂解物于室温静置5min后，加入0.2ml三氯甲烷，小心盖上管盖，剧烈摇动15s。

注意：请不要漩涡震荡，避免引入DNA污染。

3.       将离心管再次置于室温2-3min，然后4℃，12,000 x g离心15min。

注意：离心会使溶液分为三相，含有RNA的水相上清液，包含蛋白和DNA的中层以及包含DNA的下层有机相。在 4℃离心对于溶液的分层是非常关键的。

4.       将上清水相转移至另一新的无RNA酶离心管中，并加入1.5倍体积的100%乙醇，漩涡振荡混匀5s。

5.       立即吸取700μl样品以及有可能形成的沉淀，加入带有2ml收集管的离心纯化柱。轻盖盖子，10,000 x g，室温离心15s，弃尽废液。

6.       将剩余的样品转移至离心柱，重复第6步。

7.       往离心柱中加入700μl漂洗液WB，轻盖盖子，10,000 x g，室温离心15s，弃尽废液。

注意：第一次使用前请确认是否已经往漂洗液WB中加入适量无水乙醇。

8.       往离心柱中加入500μl漂洗液WB，轻盖盖子，10,000 x g，室温离心15s，弃尽废液，重复一次，之后10,000 x g离心空柱2min干燥硅胶膜。

注意：完全去除洗液对最后溶解是非常重要的，洗液的残留会影响最终的洗脱。

9.       将离心柱转移至一新的无RNA酶的1.5ml离心管中，往硅胶膜中央滴加200μl无核酸酶水，轻盖管盖，室温静置1-5min，10,000 x g 离心1min洗脱RNA。

注意：洗脱体积不宜小于200μl，否则会影响洗脱效果。

10.   把洗脱液滴加回硅胶膜重复第10步洗脱。

11.   把溶解的RNA转移至miRNA分离柱，4℃ 10,000 x g 离心15min。

12.   将离心回收的小RNA至于冰上，保存请置于-80℃。

注：本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。