石蜡标本基因组快速提取试剂盒

FFPE sample Total Genomic DNA Extraction Kit

石蜡标本基因组快速提取试剂盒

福尔马林固定，石蜡包被（FFPE）组织样品是人们诊断和预测疾病的主要组织来源，也同时用作分子及遗传研究。但是和新鲜组织样品不同，石蜡包埋样品中大多数DNA和 RNA分子在固定时以及长期储存的过程中，降解为小片段，更进一步的是福尔马林诱导的核酸和蛋白交联限制了DNA或者RNA从被固定的细胞中释放，然而随着技术的发展，现在已经能够从石蜡包埋样品中提取到高质量的DNA和RNA。

石蜡包埋样品基因组抽提试剂采用独特的配方，能高效的进行石蜡样品脱蜡前处理，裂解组织及其细胞，甚至是用于富含脂肪的组织，同时结合特制的纯化柱，能最大限度的保持DNA的完整性、高得率以及纯度。

 【试剂盒组成】

注意：使用前请在蛋白酶K管中加入适量灭菌双蒸水至20mg/ml，漂洗液WB1和WB2中加入适量无水乙醇。

【试剂运输及储存条件】

试剂运输可在常温环境下进行。储存时，蛋白酶K干粉于4℃保存，RNA酶A和稀释后的蛋白酶K溶液于-20℃保存，试剂盒其余组分室温保存。

【操作步骤】

1.       切下5片厚度约为10μm（重约10mg）的组织块，尽量切去石蜡部分，置于1.5ml的离心管中。

注意：该实验流程只适用于在10mg左右的组织样品中抽提总RNA，样品不宜过多，否则消化组织是非常困难的。加入1ml二甲苯，并振荡30s，然后室温放置5分钟。振荡离心管20s，然后室温，14000 x g离心3min。用移液器移去上清，室温干燥组织沉淀15min。之后操作见第2步。

2.       往裂解物中依次加入280μl裂解液PDB,5μl RNA酶A和10μl蛋白酶K（20mg/ml）溶液,用移液器吸打混匀，于55℃温水浴消化30min。

    注意：请不要漩涡震荡

4.  往裂解物中加入200μl三氯甲烷，颠倒或摇动混匀，室温静置1min，11,000xg室温离心10min。

    注意：请不要漩涡震荡

5.  小心吸取上清至一新的1.5ml离心管中，往裂解物中加入0.6倍上清体积的预冷异丙醇，轻柔颠倒混匀。

6.  立即吸取700μl样品以及有可能形成的沉淀，加入带有2ml收集管的离心纯化柱。轻盖盖子，11,000xg，室温离心1min，收集流穿液在另一新的1.5ml离心管中。

7.  将剩余的样品转移至离心柱，重复第6步。

8.  往离心柱中加入700μl漂洗液WB1，轻盖盖子，室温静置1min，11,000xg，室温离心1min，弃尽废液。

注意：第一次使用前请确认是否已经往漂洗液WB1中加入适量无水乙醇。

9.  往离心柱中加入500μl漂洗液WB2，11,000xg , 室温离心1min，弃尽废液。

注意：第一次使用前请确认是否已经往漂洗液WB2中加入适量无水乙醇。

10. 往离心柱中加入500μl漂洗液WB2，11,000xg , 室温离心1min，弃尽废液。

11. 11,000xg离心空柱1min干燥硅胶膜。

12.   将离心柱转移至新的无核酸酶的1.5ml离心管中，往硅胶膜中央滴加50μl洗脱液EB，轻盖管盖，室温静置2-3min，11,000xg离心1min洗脱基因组DNA。

13.   把洗脱液滴加回硅胶膜重复第12步洗脱。

14.   如需后续操作，请始终将溶解的DNA至于冰上，保存请置于-80℃。

【DNA定量】

实例：用常规比色皿测量RNA浓度。

DNA样品总体积：50μl

稀释因子，1:100（10μl DNA样品+990μl无核酸酶高压灭菌水）

A260读值：0.20（在1ml比色皿中测量）

因此，DNA样品浓度= 50×A260×稀释因子=50×0.20×100=1000μg/ml

DNA样品的得率=1000×0.05=50μg

实例：用超微量比色皿测量DNA浓度。

DNA样品总体积：50μl

稀释因子，1:100（1 μl DNA样品+99 μl无核酸酶高压灭菌水）

A260读值：0.20（在超微比色皿中测量）

因此，DNA样品浓度= 50×A260×稀释因子=50×0.20×100=1000μg/ml

DNA样品的得率=1000×0.05=50μg

【注意事项】

1. 操作时请使用一次性手套和口罩。

2. 第一次使用前请确认是否已经往漂洗液WB1和WB2中加入适量乙醇。

3. 第一次使用前请确认是否已经往蛋白酶K管中加入适量灭菌双蒸水。

4. 洗脱液EB如预先在65℃温水浴，会提高基因组DNA的回收率。

注：本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。