质粒小量快速提取试剂盒

质粒小量快速提取试剂盒

【产品简介】

   本试剂盒将独特的碱裂解法和特制的DNA吸附柱相结合，可以有效的去除试剂和内毒素的污染，从而得到高浓度、高纯度的质粒，能应用于基因文库构建、酶切、体外转录、测序、转染、PCR等多种后续实验。

【试剂盒组成】

【试剂运输及储存条件】

试剂运输可在常温环境下进行。储存时，可保存在室温。RNA酶A(10mg/ml)请保存于4℃。初次使用时请将RNA酶A全部加至溶液PB1中，溶液PB1中加入RNA酶A后于4℃保存。

【操作步骤】

1.       取1-5ml 过夜培养的菌液加入离心管中，10,000rpm 离心1 min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

2.       弃尽培养基，往离心管中加入250μl溶液PB1，震荡混匀所有菌沉淀。

注意：培养基残留会影响质粒回收率。使用溶液PB1前请先确认是否已经加入RNA酶A。请将菌沉淀全部震荡悬浮，否则会影响质粒的回收率。

3.       加入250μl溶液PB2，轻柔上下颠倒离心管8次。

注意：使用PB2前请先确认溶液PB2是否有沉淀，如有，请先于37℃加热使之溶解后使用。请勿剧烈混匀，此步骤操作不宜超过5分钟。

4.       加入350μl溶液PB3，轻柔上下颠倒离心管10次，室温静置3-5min，10000rpm离心10min。

注意：使用PB3前请先确认溶液PB3是否有沉淀析出，如有，请先于37℃加热使之溶解并混匀后使用。

5.       小心转移上清至吸附柱中，10000rpm离心2min。

注意：吸取上清时请勿吸到沉淀，以免造成基因组和蛋白污染。

6.       弃尽废液，往离心柱中加入500μl洗涤液WB，10000rpm离心1min。

7.       弃尽废液，往离心柱中加入500μl洗涤液WB，10000rpm离心1min。

注意：第一次使用洗涤液WB前请先确认是否已经加入适量体积的无水乙醇（按照试剂瓶上标签提示）。

8.       弃尽废液，10000rpm离心空柱1min，甩干残余乙醇。

注意：请勿省略此步骤，残留乙醇会影响洗脱效率。

9.       往膜中央悬空滴加50μl洗脱液EB，室温放置1分钟，10000rpm室温离心1min收集纯化产物。

10.   可将洗脱液滴加回硅胶膜重复第9步洗脱以提高得率。

【DNA定量】

本试剂盒所抽提的质粒DNA基本上没有任何有机药品的污染，因此非常适合用紫外分光光度计进行定量。DNA的浓度可以在一个石英或者紫外适用的比色皿中通过测量260nm处的吸收值来计算得到，260nm处一个单位的吸收值等于50μg/ml的DNA，这种计算关系只适用于在水中进行定量分析，因此DNA必须用无DNA酶水溶解，稀释和测量，同时为了最大限度减少差异，样品的吸收值应控制在0.1-1.0之间。然而，由于抽提得到DNA的量较少，因此我们推荐使用超微量的比色皿，适用于紫外测量的比色皿您可以从几个生物公司购得：例如BrandTech Scientific (www.brandtech.com)和Santa Cruz Biotechnology。

实例：用常规比色皿测量DNA浓度。

DNA样品总体积：50μl

稀释因子，1:100（10μl DNA样品+990μl无DNA酶高压灭菌水）

A260读值：0.20（在1ml比色皿中测量）

因此，DNA样品浓度= 50×A260×稀释因子=50×0.20×100=1000μg/ml

DNA样品的得率=1000×0.05=50μg

实例：用超微量比色皿测量DNA浓度。

DNA样品总体积：50μl

稀释因子，1:100（1 μl DNA样品+99 μl无DNA酶高压灭菌水）

A260读值：0.20（在超微比色皿中测量）

因此，DNA样品浓度= 50×A260×稀释因子=50×0.20×100=1000μg/ml

DNA样品的得率=1000×0.05=50μg

【注意事项】

1. 第一次使用前请确认是否已经往WB中加入适量无水乙醇（按照试剂瓶标签提示）。

2. 溶液PB2作用细菌太久，一方面导致基因组DNA断裂成较短的DNA，不易和其他成分一起沉淀，造成基因组DNA污染。另一方面会使质粒DNA出现切口和断裂，间接导致质粒的质量下降。裂解步骤所用时间不应超过5分钟。

3. 实验相关耗材应高压灭菌30分钟后使用。

4. 操作时请使用一次性手套和口罩，防止DNA酶污染。

5. 回收率与初始质粒DNA量和洗脱体积有关，初始量越少、洗脱体积越少，回收率越低, 可以将洗脱液从收集管中取出，重复洗脱一次。

6. 本试剂盒推荐洗脱液体积为50μl，洗脱液用量可根据客户实验具体情况灵活调整，但洗脱体积请不要小于30μl。

7. DNA也可以用缓冲液(10 mM Tris-Cl, PH8.0) 洗脱。为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤9。洗脱液的体积不应少于30μl，体积过少会影响回收的效率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其PH值在7.0-8.5范围内，PH值低于7.0会降低洗脱效率；质粒DNA产物应保存在-20℃，以防降解。

8. 含质粒的转化菌的培养时间不应超过16小时。过度培养一方面导致抗生素失效，选择压力降低，质粒丢失，无质粒细菌增多。另一方面长时间的培养条件会导致细菌崩解。

【有效期】

本试剂盒有效期为12个月，在有效期内使用。

注：本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。